幽門(mén)螺桿菌 (H. pylori) 感染是人類(lèi)最常見(jiàn)的慢性細(xì)菌感染之一，作為幽門(mén)螺桿菌的一線(xiàn)治療方案，標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)療法包括一種質(zhì)子泵抑制劑(PPI) 和兩種抗生素：克拉霉素和阿莫西林（如果對(duì)青霉素過(guò)敏，可以用甲硝唑代替阿莫西林）。shou次引入該療法時(shí)，它達(dá)到了很高的根(chu)除率（> 90%）。然而，近年來(lái)該方案在世界許多地區(qū)的療效一直在下降，根(chu)除率<80%，不再適合臨床實(shí)踐。根(chu)除率低的原因可能涉及不適當(dāng)?shù)闹委煛⒒颊咭缽男圆睢⑽鼰煛YP2C19 基因多態(tài)性和胃中的高細(xì)菌負(fù)荷。幽門(mén)螺桿菌對(duì)抗生素的耐藥性通常被認(rèn)為是根(chu)除失敗的主要原因。突變?cè)谟拈T(mén)螺桿菌的抗生素耐藥性中起重要作用。作為zui常用的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物之一，克拉霉素通過(guò)可逆地與細(xì)菌23S rRNA分子50S核糖體亞基的結(jié)構(gòu)域V的肽基轉(zhuǎn)移酶環(huán)結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成。據(jù)報(bào)道，23S rRNA 基因域 V 中的點(diǎn)突變與克拉霉素耐藥性相關(guān)。A2142G 和 A2143G 的點(diǎn)突變（transtions）是zui普遍的突變。氟喹諾酮類(lèi)藥物通過(guò)抑制 DNA 促旋酶的活性來(lái)干擾細(xì)菌中 DNA 的合成。幽門(mén)螺桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的抗性與 gyrA 基因喹諾酮類(lèi)藥物抗性決定區(qū)的點(diǎn)突變有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)方法

幽門(mén)螺桿菌菌株分離：重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院消化內(nèi)科門(mén)診對(duì)156例疑似幽門(mén)螺桿菌感染患兒進(jìn)行胃活檢，在調(diào)查前的最后2個(gè)月內(nèi)，所有兒童均未服用任何H2受體拮抗劑、PPI、鉍和抗生素。通過(guò)上消化道內(nèi)鏡在胃竇處采集胃黏膜活檢標(biāo)本，樣本經(jīng)處理培養(yǎng)后，對(duì)疑似透明菌落通過(guò)革蘭氏染色和脲酶、過(guò)氧化氫酶、氧化酶活性試驗(yàn)鑒定，然后確定幽門(mén)螺桿菌。

抗生素藥敏試驗(yàn)：采用瓊脂稀釋法檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌菌株對(duì)六種抗生素（克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星、阿莫西林、四環(huán)素和呋喃唑酮）的耐藥性。將幽門(mén)螺桿菌懸浮液接種到含有5% 羊血和臨界濃度的單一抗生素的培養(yǎng)板上，然后在微需氧條件下在37°C 下孵育 3 至 5 天。抗生素折點(diǎn)（breakpoints）為克拉霉素≥1.0 μg/mL、甲硝唑≥8.0 μg/mL、左氧氟沙星≥2.0 μg/mL、阿莫西林≥2.0 μg/mL、四環(huán)素≥2.0 μg/mL、呋喃唑酮≥2.0 μg/mL。試驗(yàn)中ACTC11637用作對(duì)照菌株。

23S rRNA 和 gyrA 基因的突變分析：

提取分離菌株的DNA，設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增23S rRNA 和 gyrA 基因。使用 BIO-GENER PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行 Sanger 測(cè)序以檢測(cè) 23S rRNA 中 2143、2142 位、gyrA 基因中 87 和 91 位密碼子的突變。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。不同性別、年齡組和內(nèi)鏡檢查結(jié)果的耐藥發(fā)生率采用卡方檢驗(yàn)（χ2 檢驗(yàn)），概率（p）值≤0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

其中，基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中用到的PCR擴(kuò)增儀來(lái)自柏恒科技。

 結(jié)果

研究顯示，共分離出112株（71.8%）幽門(mén)螺桿菌。有56名男孩和56名女孩，所有兒童的平均年齡為9.6±3.0歲，范圍為3.0至17.9歲。112例患者中，最常見(jiàn)的癥狀是腹痛（77.7%），內(nèi)鏡下主要表現(xiàn)為幽門(mén)螺桿菌相關(guān)性胃炎（86.6%），僅有15例患者出現(xiàn)十二指腸潰瘍。在 112 個(gè)樣本中，102 個(gè)菌株檢測(cè)到 23S rRNA 和 gyrA 基因的突變。A2143G突變率為48.0%（49/102）；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何 A2142G 突變。gyrA基因突變率為16.7%（17/102），在17株菌株中，對(duì)應(yīng)Asn87和Asp91的突變率分別為9.8%（10/102）和6.9%（7/102）。研究人員還發(fā)現(xiàn)11株同時(shí)具有23S rRNA和gyrA基因突變。沒(méi)有觀察到 Asn87 和 Asp91 突變之間的 MIC (zui低抑菌濃度)值有顯著差異(p>0.05)。

討論

許多國(guó)家都報(bào)道了兒童對(duì)克拉霉素的耐藥性，其患病率從 16.0% 到 50.9% 不等。在該研究中，克拉霉素的耐藥率為47.3%，高于中國(guó)其他地區(qū)以往報(bào)道（16.4-31.8%），但低于北京（84.9-96.6%）。歐洲的一項(xiàng)多中心研究分析了門(mén)診社區(qū)中抗生素使用與抗生素耐藥性之間的關(guān)系，以治療幽門(mén)螺桿菌感染，并表明長(zhǎng)效大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的使用與幽門(mén)螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥性相關(guān)。在大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)中也觀察到強(qiáng)烈的交叉耐藥性。因此，中國(guó)幽門(mén)螺桿菌感染兒童對(duì)克拉霉素的高耐藥性可能歸因于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物在呼吸系統(tǒng)和其他疾病中的頻繁使用。 在臨床實(shí)踐中調(diào)節(jié)和限制大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的給藥可能有利于降低高耐藥性。

重慶市幽門(mén)螺旋桿菌感染兒童對(duì)克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星耐藥率較高。大多數(shù)克拉霉素耐藥菌株均檢測(cè)到A2143G突變，而gyrA突變點(diǎn)的Asn87和Asp91在左氧氟沙星耐藥菌株中常見(jiàn)。在臨床實(shí)踐中，抗幽門(mén)螺桿菌治療應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)個(gè)體化。

在今天的介紹中，我們了解了關(guān)于幽門(mén)螺桿菌耐藥一些情況及背后分子層面機(jī)理，對(duì)于我們預(yù)防和治療幽門(mén)螺桿菌提供了不少信息。分子層面研究可以用到的PCR儀簡(jiǎn)介如下，歡迎咨詢(xún)了解更多。

PCR儀產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 RePure系列智能二維梯度PCR儀

本系列PCR儀具有二維梯度摸索功能，多種梯度摸索模式；

自適應(yīng)壓桿式熱蓋，合蓋緊蓋一步到位；

前進(jìn)后出式風(fēng)道，機(jī)器可并排放置，節(jié)約實(shí)驗(yàn)空間；

 Q3200系列熒光定量PCR儀

本系列熒光PCR儀采用四通道雙16孔模塊設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用；

最大升降溫速率8℃/s，大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間；

體積小，重量輕，方便攜帶。